产品简介

鬼笔环肽（Phalloidin），又称鬼笔鹅膏素，最初是从毒蘑菇鬼笔鹅膏菌(Amanita phalloides)中分离到的一种双环肽，以极高的亲和力和特异性与肌动蛋白丝F-actin结合，不会结合单体肌动蛋白（G-actin）。鬼笔环肽对大小纤维的亲和力相近，在许多不同的动植物物种的肌肉和非肌肉细胞中，基本都按照一个肌动蛋白亚基与一个鬼笔环肽分子的化学计量比结合。不像肌动蛋白抗体，对不同物种或来源的机动蛋白亲和力会发生明显变化。鬼笔环肽的非特异性结合几乎可以忽略，染色和未染色区域的差异非常明显。鬼笔环肽及其衍生物在纳摩尔浓度即可对F-actin染色，可以非常方便的标记、识别和定量研究F-actin的分布。

本产品为荧光染料IF555标记的鬼笔环肽，按照每孔细胞染色使用100 μL工作液，本产品可进行100次细胞染色。

保存条件

-20℃避光保存，有效期一年。

实验前准备

1. 自备1×PBS缓冲液（pH 7.2-7.4），BSA，固定液（含4%多聚甲醛），破膜液（溶于PBS的0.1%-0.5% Triton X-100），抗荧光淬灭封片剂，即用型DAPI染色液等。

2. 第一次使用本产品时，充分融化后低速离心1 min，防止液体管壁损失。建议根据单次实验使用量进行分装，防止溶剂挥发损失。置于-20℃避光保存。

3. 正式实验前，配制含1% BSA的PBS，即每100 mL PBS溶解1.0 g BSA。然后吸取1 μL IF555-鬼笔环肽与200 μL-500 μL含1% BSA的PBS混匀，即得到1×的鬼笔环肽染色工作液。

不同类型的细胞染色效果可能不同，最佳染色工作浓度请参考文献或进行预实验摸索。

鬼笔环肽染色工作液现配现用，室温避光保存，当天使用。

使用方法

1. 培养好的细胞爬片（密度至少达到半汇合），去除培养液，用37℃预热的1×PBS缓冲液清洗细胞清洗细胞2次；

2. 加入含3.0-4.0%甲醛的固定液覆盖细胞，室温固定15-30 min；

注意：甲醇能破坏肌动蛋白，因此固定液中不得含有甲醇，避免使用含甲醇的甲醛溶液；

3. 室温条件下，用1×PBS缓冲液清洗细胞2-3次，每次10 min；

4. 室温条件下，用含0.1% Triton X-100 的PBS覆盖细胞，室温透化细胞5 min；

5. 室温条件下，用1×PBS缓冲液清洗细胞2-3次，每次10 min；

6. 细胞爬片稍微甩干后，用组化笔画圈使细胞位于圈中央。取100 μL现配的IF555-鬼笔环肽染色工作液完全覆盖细胞，室温避光孵育30-120 min。注意，通常情况下，4-37℃均适合染色。为避免染色工作液挥发导致干片，孵育过程需将细胞爬片置于密封容器内，例如避光湿盒。此外，鬼笔环肽染色工作液中加入1% BSA可有效降低背景；

7. 用1×PBS缓冲液清洗细胞2-3次，每次5 min；

8. （可选做）向爬片上滴加即用型DAPI染色液覆盖细胞，进行细胞核染色3-5 min。用1×PBS缓冲液清洗细胞2-3次，每次30-60 s；

9. 细胞爬片稍甩干后，倒置在滴加一滴抗荧光淬灭封片剂的载玻片上，用纸巾吸掉对于封片剂；

【可选步骤】：完成步骤7后，也可直接将盖玻片倒置在滴加含DAPI的抗荧光淬灭封片剂的载玻片上，然后吸掉多余的封片剂。以荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察结果。

10. 荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察结果，选择IF555（Ex/Em=556/574 nm）和DAPI（Ex/Em=364/454 nm）通道；

注意事项：

1. 荧光标记鬼笔环肽一个单位（T）的定义是染色一个加载细胞的载玻片所用染料的量。

2. 甲醇可以破坏Actin蛋白，因此样本前期固定不能使用含有甲醇的固定液，固定时间建议控制在15-30 min之间最佳。

3. 鬼笔环肽通常不具有细胞通透性，极少用于活细胞染色。

4. 荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽快完成检测及观察拍照。

5. 鬼笔环肽具有毒性，需小心操作，操作时请穿实验服，并佩戴一次性手套。