产品简介

本产品TSAPLus荧光5标6色染色试剂盒，适用于石蜡切片、冰冻切片、组织漂片、细胞爬片、细胞涂片、类器官等组织样本的免疫荧光多重染色，尤其适用于相同来源一抗的多重荧光免疫标记，也可用于不同来源抗体的多重荧光免疫标记 。主要原理是基于酪胺信号放大（TSA， Tyramide signal amplification），以下简称TSA技术。TSA技术主要原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应（即荧光标记的酪胺盐在 HRP催化 H₂O₂下形成共价键结合位点），产生大量的酶促反应，该产物能与周围的蛋白残基（包括色氨酸、组氨酸、酪氨酸残基）结合，在抗原-抗体结合部位形成大量的荧光素沉积，实现信号放大。本试剂盒使用荧光染料 440/488/546/594/647对酪胺进行标记，得到的荧光酪胺荧光强，信号稳定，应用于多次重复免疫标记实现多重荧光染色。

除了本试剂盒内的荧光染料组合之外，也可以根据用户的荧光成像系统光源配置选择其他合适的荧光染料进行搭配组合试剂盒，开展TSA荧光多标实验，请联系我司。

组成

实验前准备

1. 自备抗原修复液（根据抗体及组织类型选择合适的抗原修复液，柠檬酸抗原修复液（pH 6.0），Tris-EDTA抗原修复液（pH 8.0），Tris-EDTA抗原修复液（pH 9.0）；

2. 自备PBS磷酸盐缓冲液；

3. 自备TBST缓冲液;

4. 自备3% H₂O₂和0.3% H₂O₂；

5. 自备各种封闭用血清（根据抗体类型选择合适的封闭血清，推荐牛血清白蛋白 BSA，正常驴血清，正常兔血清，正常山羊血清）；

6. 自备所需一抗；

7. 自备对应HRP标记二抗；

8. 每轮抗体标记完成后，需要进行抗体洗脱，除了常规的高温加热洗脱以外，强烈推荐本公司的免疫染色抗体洗脱液，用此抗体洗脱液洗脱法相比高温加热洗脱法更温和，可避免多次加热对组织形态结构造成损伤破坏，同时能将一抗二抗彻底洗脱去除。

9. 根据用量，按照下表比例配制 TSA 染色工作液。

注：荧光 Tyramide 融化后离心机短时离心，干净吸头吹吸混匀后取用。TSA 染色工作液建议现配现用，需 4℃避光保存，24h内有效。

操作步骤

以石蜡组织切片为例，以下实验步骤中的实验用水均为纯水：

1．石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入环保型脱蜡液I 10min-环保型脱蜡液II 10min-环保型脱蜡液III 10min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-无水乙醇Ⅲ5min-蒸馏水洗。

2．抗原修复：根据组织类型及抗体种类，选择对应的抗原修复液及修复方式进行抗原修复。一般修复方式为抗原修复仪，微波，高压等高温修复。此过程中应防止修复液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3．画圈,双氧水封闭：切片稍甩干后用组化笔沿着组织周围画圈，一般距离组织3mm左右，画完圈待圈干后用纯水或PBS润洗一遍，之后将切片放入3%双氧水溶液中，室温避光孵育25 min，封闭内源性的过氧化物酶。封闭完成后将玻片置于PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4．血清封闭: 切片稍微甩干后，向组织上滴加3%BSA或血清室温封闭30min，具体根据一抗及二抗种属决定封闭试剂。

5．加第一种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内，4°C孵育过夜。（湿盒底部加少量水防止抗体蒸发）

6．加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。

7．加iF440-TSA：玻片置于PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加配制好的iF440-TSA工作液，避光室温孵育10min。孵育完后，玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

8．抗体洗脱：

8.1 微波处理：组织切片置于盛满抗原修复液（根据组织类型及抗体选择合适的抗原修复液）的修复盒中进行微波加热处理，去除已经结合的一抗二抗。（加热的温度和时间建议：加热到95℃以上，维持15分钟。）此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；

8.2 免疫染色抗体洗脱液处理（强烈推荐）：切片稍甩干后将恢复至室温的抗体洗脱液铺满整个组织，室温孵育5min后去除抗体洗脱液，再次滴加足量的抗体洗脱液完全覆盖组织，37°C孵育30min，孵育完成后将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

9．血清封闭: 切片稍微甩干后，向组织上滴加3%BSA或血清室温封闭30min，具体根据一抗及二抗种属决定封闭试剂。

10．加第二种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内，4°C孵育过夜。（湿盒底部加少量水防止抗体蒸发）

11．加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。

12．加iF488-TSA：玻片置于PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加配制好的iF488-TSA工作液，避光室温孵育10min。孵育完后，玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

13．抗体洗脱：

13.1 微波处理：组织切片置于盛满抗原修复液（根据组织类型及抗体选择合适的抗原修复液）的修复盒中进行微波加热处理，去除已经结合的一抗二抗。（加热的温度和时间建议：加热到95℃以上，维持15分钟。）此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；

13.2 免疫染色抗体洗脱液处理（强烈推荐）：切片稍甩干后将恢复至室温的抗体洗脱液铺满整个组织，室温孵育5min后去除抗体洗脱液，再次滴加足量的抗体洗脱液完全覆盖组织，37°C孵育30 min，孵育完成后将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

14．血清封闭: 切片稍微甩干后，向组织上滴加3%BSA或血清室温封闭30min，具体根据一抗及二抗种属决定封闭试剂。

15．加第三种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内，4°C孵育过夜。（湿盒底部加少量水防止抗体蒸发）

16．加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。

17．加iF546-TSA：玻片置于PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加配制好的iF546-TSA工作液，避光室温孵育10min。孵育完后，玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

18．抗体洗脱：

18.1 微波处理：组织切片置于盛满抗原修复液（根据组织类型及抗体选择合适的抗原修复液）的修复盒中进行微波加热处理，去除已经结合的一抗二抗。（加热的温度和时间建议：加热到95℃以上，维持15分钟。）此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；

18.2 免疫染色抗体洗脱液处理（强烈推荐）：切片稍甩干后将恢复至室温的抗体洗脱液铺满整个组织，室温孵育5min后去除抗体洗脱液，再次滴加足量的抗体洗脱液完全覆盖组织，37°C孵育30min，孵育完成后将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

19．血清封闭: 切片稍微甩干后，向组织上滴加3%BSA或血清室温封闭30min，具体根据一抗及二抗种属决定封闭试剂。

20．加第四种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内，4°C孵育过夜。（湿盒底部加少量水防止抗体蒸发）

21．加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。

22．加iF594-TSA：玻片置于PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加配制好的iF594-TSA工作液，避光室温孵育10min。孵育完后，玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

23．抗体洗脱：

23.1 微波处理：组织切片置于盛满抗原修复液（根据组织类型及抗体选择合适的抗原修复液）的修复盒中进行微波加热处理，去除已经结合的一抗二抗。（加热的温度和时间建议：加热到95℃以上，维持15分钟。）此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；

23.2 免疫染色抗体洗脱液处理（强烈推荐）：切片稍甩干后将恢复至室温的抗体洗脱液铺满整个组织，室温孵育5min后去除抗体洗脱液，再次滴加足量的抗体洗脱液完全覆盖组织，37°C孵育30min，孵育完成后将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

24．血清封闭: 切片稍微甩干后，向组织上滴加3%BSA或血清室温封闭30min，具体根据一抗及二抗种属决定封闭试剂。

25．加第五种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内，4°C孵育过夜。（湿盒底部加少量水防止抗体蒸发）

26．加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。

27．加iF647-TSA：玻片置于PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加配制好的iF647-TSA工作液，避光室温孵育10min。孵育完后，玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

28．DAPI复染细胞核：切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

29．自发荧光淬灭：玻片置于PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后，在圈内加入组织自发荧光淬灭剂避光孵育5min，流水冲洗10min。

30．封片：切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

31．镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像，也可用荧光扫描仪扫描成像。切片置于避光切片盒内4℃可保存15天。

储存与运输

试剂盒内各组分按各自所需条件保存，冰袋运输。12个月有效。

注意事项

1. 与荧光二抗相比，TSA试剂盒有更高的灵敏度和更强的信号。因此一抗使用浓度需降低，一般在抗体说明书建议的稀释比基础上再扩大5-10倍，以减少非特异性结合导致的背景荧光。建议设置一抗梯度浓度获得最佳效果。

2. 如背景荧光较强，建议增加组织自发荧光淬灭步骤。

3. 荧光Tyramide的建议稀释比是1:500，可根据实验结果调整稀释比例（调整范围1:200 - 1:1000）。

4. 为保证抗体洗脱效果及荧光多重标记效果，正式多重标记之前需分别做各个抗体的TSA单标测试（即一抗—HRP二抗—对应多标中的TSA），确定每个抗体单标都能做出较理想的阳性后再根据单标测试结果去确定多标的抗原修复条件，抗体顺序等实验条件。

5. 如果有些抗体效价高，亲和力较强，不易洗脱彻底，可提高洗涤温度至50℃ 30min，或增加洗脱次数，即组织上加入抗体洗脱液 37℃孵育 30min后，去掉抗体洗脱液，再加入新的抗体洗脱液，继续 37℃孵育 30min。

6. 此抗体洗脱液流动性强，片子未水平放置时，试剂易流出圈外，影响洗脱效果，需在操作过程注意切片平放。

7. 操时需带手套，口罩，穿实验服，避免试剂接触皮肤和眼睛。如不慎接触到敏感区域，立即用大量清水冲洗。