RNASweAMI原位杂交简介

原位杂交（In situ hybridization），即ISH技术，基本原理是基于碱基互补配对原则，利用特定标记（如荧光素、地高辛等）的已知序列单链核酸作为探针，与待检测的细胞或组织切片中的靶基因（DNA或RNA）特异性结合，二者经碱基互补配对，形成靶基因与标记探针的杂交体。随后根据探针的标记物，利用不同的显色系统对杂交体进行显色及信号放大，从而对靶基因进行精确定量定位。根据探针的标记物不同，有荧光显色系统、DAB显色系统等。

RNASweAMI ISH原位杂交技术检测流程如图1所示，特异性的寡核苷酸探针通过碱基互补配对原则与组织样本中的靶标RNA杂交，然后通过两个“L”型结构（单链DNA）使得靶标处富集大量的信号探针，实现级联式信号放大，经明场或者荧光成像技术，可观察到靶标RNA处形成的明显点状或团簇状信号。相比于传统的原位杂交直标方法，该方法理论上可以将信号放大400-8000倍，实现单分子RNA的可视化，且具有很高信噪比。

实验前准备

1 实验流程概览

2 试剂准备

(1) 配制3% H₂O₂：将双氧水（30% H₂O₂）用无核酸酶水稀释至3%，即每1mL双氧水与9mL无核酸酶水混匀。

(2) 配制1×修复液：将修复液（20×）用无核酸酶水稀释20倍，即1mL修复液（20×）与19mL无核酸酶水混匀。

(3) 配制Proteinase K工作液：将Proteinase K用1×PBS稀释10倍，即每100μL Proteinase K与900μL 1×PBS混匀，得到Proteinase K工作液。

(4) 配制靶标探针混合物1杂交液：靶标探针混合物1用杂交液稀释5倍。

(5) 配制靶标探针混合物2杂交液：靶标探针混合物2用杂交液稀释5倍。

(6) 配制DIG信号探针杂交液：将DIG probe（200×）用杂交液稀释200倍，即每1μL DIG probe（200×）与199μL杂交液混匀。

(7) 配制anti-DIG（HRP）工作液：将anti-DIG (HRP)用1×PBS稀释400倍，即每1μL anti-DIG (HRP)与399μL 1×PBS混匀。

(8) 配制DAB显色液：将DAB显色剂A与DAB显色剂B按照1:50体积比混匀，得到DAB显色液。注意，此溶液需现配现用。

(9) 配制2×SSC：将20×SSC用无核酸酶水稀释10倍，即每1mL 20×SSC与9mL无酶水混匀。

(10) 配制1×SSC：将20×SSC用无核酸酶水稀释20倍，即每1mL 20×SSC与19mL无酶水混匀。

(11) 配制0.5×SSC：将20×SSC用无核酸酶水稀释40倍，即每1mL 20×SSC与39mL无酶水混匀。

(12) 配制0.1×SSC：将20×SSC用无核酸酶水稀释200倍，即每1mL 20×SSC与199mL无酶水混匀。

样本前处理

1 组织石蜡切片

(1) 脱蜡复水：制备好的组织石蜡切片（3-5μm）依次进入二甲苯I 15min-二甲苯II 15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%乙醇5min-75%乙醇5min-无核酸酶水。

(2) 热修复：1×修复液置于抗原修复盒内，将组织切片浸没于1×修复液中，将抗原修复盒置于提前加温至100℃的水浴锅内，继续保温至1×修复液沸腾并维持15min，然后取出抗原修复盒，自然冷却至室温，1×PBS清洗3次，每次5min。

(3) 消化：用免疫组化笔画圈圈住组织，向圈内滴加Proteinase K工作液覆盖组织，置于37℃消化20-30min，之后切片经1×PBS洗3次，每次5min。（最优消化条件需根据实际实验情况进行优化调整，以获得最佳实验效果）

2 组织冰冻切片

(1) 固定：冰冻切片经室温静置5-10min复温干燥后，滴加试剂盒内配套的固定液覆盖组织，室温固定10-15min，晾干后以1×PBS清洗3次，每次5min。

(2) 消化：用免疫组化笔画圈圈住组织，向圈内滴加Proteinase K工作液覆盖组织，置于37℃消化5-15min，之后切片经1×PBS洗3次，每次5min。（最优消化条件需根据实际实验情况进行优化调整，以获得最佳实验效果，必要时可用修复液高温修复）。

3 贴壁细胞样本

(1) 固定：去除细胞培养板中的培养基，用1×PBS缓冲液（无核酸酶）清洗1次，之后向孔板内加入固定液1-2mL覆盖细胞，室温固定10-15min后，以1×PBS清洗3次，每次5min。

(2) 破膜：在细胞培养板中滴加300-500μL通透剂覆盖细胞，室温孵育20min后，1×PBS洗3次，每次5min。

(3) 消化：细胞培养板稍甩干后，用免疫组化笔在细胞培养板边缘均匀画圈，向圈内加50-100μL Proteinase K工作液37℃消化5-10min。细胞培养板经1×PBS润洗3次，每次5min。（最优消化条件需根据实际实验情况进行优化调整，以获得最佳实验效果）

4 悬浮细胞样本

(1) 涂片：将收集的适量细胞重悬于1×PBS缓冲液（无核酸酶）中，吸取50-100μL细胞悬液滴于防脱玻片上，使用一片洁净的载玻片轻柔涂开细胞悬液；

(2) 固定：滴加试剂盒内配套的固定液完全覆盖组织，室温固定10-15min后，以1×PBS清洗3次，每次5min。

(3) 破膜：在细胞培养板中滴加300-500μL通透剂覆盖细胞，室温孵育20min后，1×PBS洗3次，每次5min。

(4) 消化：细胞培养板稍甩干后，用免疫组化笔在细胞培养板边缘均匀画圈，向圈内加50-100μL Proteinase K工作液37℃消化5-10min。细胞培养板经1×PBS润洗3次，每次5min。（最优消化条件需根据实际实验情况进行优化调整，以获得最佳实验效果）

原位杂交检测

(1) 双氧水封闭：将预处理好的切片浸没在3% H₂O₂溶液内，室温避光孵育15min。然后用PBS清洗切片3次，每次5min。

(2) 预杂交：轻轻甩干切片后，将切片水平置于湿盒内，滴加40℃预热的杂交液覆盖样本，盖上湿盒盖子，将湿盒整体置于预热的杂交仪内40℃孵育30min，此过程需注意防止干片。

(3) 靶标探针1杂交：探针孵育：倾去杂交液，滴加40℃预热的靶标探针混合物1杂交液约60μL覆盖样本，水平置于湿盒内，然后将湿盒置于杂交仪内40°C孵育3h（或40℃孵育过夜），此过程需注意密封湿盒防止干片。

(4) 杂交后洗涤：倾去靶标探针混合物1杂交液，切片依次经40°C预热的2×SSC、1×SSC、0.5×SSC、0.1×SSC于40℃漂洗，各5min。注意：若非特异性杂交体较多，可以在此步增加洗涤时间、次数及调整杂交液中甲酰胺浓度。

(5) 靶标探针2杂交：轻轻甩干切片，滴加40℃预热的靶标探针混合物2杂交液约60μL覆盖样本，水平置于湿盒内，将湿盒置于杂交仪内40℃孵育45min。注意：湿盒底部加入50mL 2×SSC，防止干片。

(6) 杂交后洗涤：倾去靶标探针混合物2杂交液，切片依次经40°C预热的2×SSC、1×SSC、0.5×SSC、0.1×SSC于40℃漂洗各5min。注意：若非特异性杂交体较多，可以在此步增加洗涤时间、次数及调整杂交液中甲酰胺浓度。

(7) 地高辛信号探针杂交：轻轻甩干切片，滴加37℃预热的DIG信号探针杂交液约60μL覆盖样本，水平置于湿盒内，将湿盒置于杂交仪内37℃孵育3h。注意：湿盒底部加入50mL 2×SSC，防止干片。

(8) 杂交后洗涤：倾去DIG信号探针杂交液，切片依次经37°C预热的2×SSC、1×SSC、0.5×SSC、0.1×SSC于37℃漂洗各5min。注意：若非特异性杂交体较多，可以在此步增加洗涤时间、次数及调整杂交液中甲酰胺浓度。

(9) 封闭：轻轻甩干切片，向切片上滴加封闭液覆盖组织，室温孵育30min。

(10) HRP地高辛抗体标记：轻轻甩干切片，滴加anti-DIG（HRP）工作液覆盖样本，置于37°C孵育50min，然后切片经1×PBS漂洗4次，每次5min。

(11) DAB显色：向切片上滴加DAB显色液覆盖组织，实时显微镜观察，至显色程度合适后用纯水冲洗。

(12) 复染细胞核：切片经苏木素染液染色3min，自来水洗，经苏木素分化液分化3-5s，自来水洗，再经苏木素返蓝液处理3-5s，流水冲洗。

(13) 脱水封片：切片依次进入75%乙醇5min-85%乙醇5min-无水乙醇I 5min-无水乙醇II 5min-二甲苯透明5min。将切片从二甲苯中拿出稍晾干后，滴加中性树胶或超净快干封片胶封片。

(14) 检测结果观察：使用标准明场显微镜观察切片，在适当倍数（20×-40×）物镜下，靶标探针检测结果呈现为细胞内的棕色点状或团簇状信号，细胞核呈深蓝色。

储存与运输

冰袋运输，-20℃保存，有效期一年