RNASweAMI原位杂交简介

原位杂交（In situ hybridization），即ISH技术，基本原理是基于碱基互补配对原则，利用特定标记（如荧光素、地高辛等）的已知序列单链核酸作为探针，与待检测的细胞或组织切片中的靶基因（DNA或RNA）特异性结合，二者经碱基互补配对，形成靶基因与标记探针的杂交体。随后根据探针的标记物，利用不同的显色系统对杂交体进行显色及信号放大，从而对靶基因进行精确定量定位。根据探针的标记物不同，有荧光、DAB、BCIP/NBT显色系统等。

RNASweAMI ISH原位杂交技术检测流程如图1所示，特异性的寡核苷酸探针通过碱基互补配对原则与组织样本中的靶标RNA杂交，然后通过两个“L”型结构（单链DNA）使得靶标处富集大量的信号探针，实现级联式信号放大，经明场或者荧光成像技术，可观察到靶标RNA处形成的明显点状或团簇状信号。相比于传统的原位杂交直标方法，该方法理论上可以将信号放大400-8000倍，实现单分子RNA的可视化，且具有很高信噪比。

1 实验前准备

1.1 实验流程概览

1.2 试剂准备

(1) 配制1×修复液：将修复液（20×）用无核酸酶水稀释20倍，即1mL修复液（20×）与19mL无核酸酶水混匀。

(2) 配制Proteinase K工作液：将Proteinase K用1×PBS稀释10倍，即每100μL Proteinase K与900μL 1×PBS混匀，得到Proteinase K工作液。

(3) 配制靶标探针混合物1杂交液：靶标探针混合物1用杂交液稀释5倍。

(4) 配制靶标探针混合物2杂交液：靶标探针混合物2用杂交液稀释5倍。

(5) 配制DIG信号探针杂交液：将DIG probe（300×）用杂交液稀释300倍，即每1μL DIG probe（300×）与299μL杂交液混匀。

(6) 配制anti-DIG（AP）工作液：将anti-DIG (AP)用1×PBS稀释400倍，即每1μL anti-DIG (AP)与399μL 1×PBS混匀。

(7) 配制封闭工作液：将试剂盒提供的封闭液（浓缩型）用1×PBS稀释10-20倍即可。

(8) 配制BCIP/NBT显色液：按1mL无核酸酶水加50μL显色剂A和50μL显色剂B，混匀。注意，此溶液需现配现用。

(9) 配制2×SSC：将20×SSC用无核酸酶水稀释10倍，即每1mL 20×SSC与9mL无酶水混匀。

(10) 配制1×SSC：将20×SSC用无核酸酶水稀释20倍，即每1mL 20×SSC与19mL无酶水混匀。

(11) 配制0.5×SSC：将20×SSC用无核酸酶水稀释40倍，即每1mL 20×SSC与39mL无酶水混匀。

(12) 配制0.1×SSC：将20×SSC用无核酸酶水稀释200倍，即每1mL 20×SSC与199mL无酶水混匀。

2样本前处理

2.1 植物组织石蜡切片

(1) 组织固定：组织PBS漂洗后立即放入原位杂交固定液中4℃固定12h以上，真空泵抽气，可4℃保存运输。

(2) 脱水浸蜡包埋：组织固定完成后在通风橱内切取目的区域组织块约3mm厚，经由低到高梯度酒精脱水后二甲苯透明，浸蜡包埋。

(3) 石蜡切片：组织石蜡块经切片机切片6μm厚，摊片机捞片，62°烤箱烤片2h。

(4) 脱蜡复水：制备好的组织石蜡切片依次进入二甲苯I 15min-二甲苯II 15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%乙醇5min-75%乙醇5min-无核酸酶水。

(5) 微波修复：取适量1×修复液置于抗原修复盒内，将组织切片浸没于1×修复液中，将抗原修复盒放于微波炉，中火7min，停火7min，低火10min（微波炉温度控制在85°左右），然后取出抗原修复盒，自然冷却至室温，1×PBS清洗3次，每次5min。

(6) 消化：用免疫组化笔画圈圈住组织，向圈内滴加Proteinase K工作液覆盖组织，置于37℃消化20-30min，之后切片经1×PBS洗3次，每次5min。（最优消化条件需根据实际实验情况进行优化调整，以获得最佳实验效果）

2.2植物组织冰冻切片

(1) 固定：冰冻切片经室温静置5-10min复温干燥后，滴加试剂盒内配套的固定液覆盖组织，室温固定10-15min，晾干后以1×PBS清洗3次，每次5min。

(2) 微波修复：1×修复液置于抗原修复盒内，将组织切片浸没于1×修复液中，将抗原修复盒放于微波炉，中火7min，停火7min，低火10min（微波炉温度控制在85°左右），然后取出抗原修复盒，自然冷却至室温，1×PBS清洗3次，每次5min。

(3) 消化：用免疫组化笔画圈圈住组织，向圈内滴加Proteinase K工作液覆盖组织，置于37℃消化5-15min，之后切片经1×PBS洗3次，每次5min。（最优消化条件需根据实际实验情况进行优化调整，以获得最佳实验效果，必要时可用修复液高温修复）。

3 原位杂交检测

(1) 预杂交：轻轻甩干切片后，将切片水平置于湿盒内，滴加杂交液（恢复室温）覆盖样本，盖上湿盒盖子，将湿盒（事先预热）整体置于预热的杂交仪内65℃孵育25min，此过程需注意防止干片。

(2) 靶标探针1杂交：探针孵育：倾去杂交液，滴加靶标探针混合物1杂交液（恢复室温）约60μL覆盖样本，水平置于湿盒内，然后将湿盒置于杂交仪内37°C孵育过夜，此过程需注意密封湿盒防止干片。

(3) 杂交后洗涤：倾去靶标探针混合物1杂交液，切片依次经37°C预热的2×SSC、1×SSC、0.5×SSC、0.1×SSC于室温漂洗，各10min。注意：若非特异性杂交体较多，可以在此步增加洗涤时间、次数及调整杂交液中甲酰胺浓度。

(4) 靶标探针2杂交：轻轻甩干切片，滴加靶标探针混合物2杂交液（恢复室温）约60μL覆盖样本，水平置于湿盒内，将湿盒置于杂交仪内37℃孵育25min。注意：湿盒底部加入50mL 2×SSC，防止干片。

(5) 杂交后洗涤：倾去靶标探针混合物2杂交液，切片依次经37°C预热的2×SSC、1×SSC、0.5×SSC、0.1×SSC于室温漂洗各5min。注意：若非特异性杂交体较多，可以在此步增加洗涤时间、次数及调整杂交液中甲酰胺浓度。

(6) 地高辛信号探针杂交：轻轻甩干切片，滴加DIG信号探针杂交液（恢复室温）约60μL覆盖样本，水平置于湿盒内，将湿盒置于杂交仪内37℃孵育3h。注意：湿盒底部加入50mL 2×SSC，防止干片。

(7) 杂交后洗涤：倾去DIG信号探针杂交液，切片依次经37°C预热的2×SSC、1×SSC、0.5×SSC、0.1×SSC于室温漂洗各5min。注意：若非特异性杂交体较多，可以在此步增加洗涤时间、次数及调整杂交液中甲酰胺浓度。

(8) 封闭：轻轻甩干切片，向切片上滴加封闭工作液覆盖组织，室温孵育30min。

(9) AP地高辛抗体标记：轻轻甩干切片，滴加anti-DIG（AP）工作液覆盖样本，置于4°C孵育过夜，然后切片经1×TBS（无酶）漂洗4次，每次5min。

(10) BCIP/NBT显色：向切片上滴加BCIP/NBT显色液覆盖组织，一般避光显色3-5min。若无背景出现则可继续显色。直至显色满意为止。

(11) 封片：显色结束后用纯水冲洗以终止反应（有需要时核固红复染），滴加甘油明胶胶封片。

(12) 检测结果观察：使用标准明场显微镜观察切片，在适当倍数物镜下，靶标探针检测结果呈现为细胞内的蓝色或蓝紫色点状或团簇状信号（若核固红复染，则细胞核呈深红色）。

储存与运输

冰袋运输，-20℃保存，有效期一年