产品简介

线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）是一种以 JC-1 为荧光探针，快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线 粒体膜电位变化的试剂盒，可以用于早期的细胞凋亡检测。 在线粒体膜电位较高时，JC-1 聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可以产生红色荧光；在线粒体膜 电位较低时，JC-1 不能聚集在线粒体的基质中，此时 JC-1 为单体，可以产生绿色荧光。这样就可以非常方 便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。 线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的标志性事件。通过 JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转变可以很 容易地检测到细胞膜电位的下降，同时也可以用 JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的 一个检测指标。

JC-1 单体的最大激发波长为515nm，最大发射波长为529nm；JC-1 聚合物的最大激发波长为585nm， 最大发射波长为590nm。实际观察时，使用常规的观察红色荧光和绿色荧光的设置即可。

本试剂盒提供了 CCCP 作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照。

对于 6 孔板中的样品，本试剂盒共可以检测约 100 个样品。

使用方法

一．JC-1 染色工作液的配制

6 孔板每孔所需 JC-1 染色工作液的量为1mL，其他培养器皿的 JC-1 染色工作液的用量以此类推：对 于细胞悬液每50～100 万细胞需 0.5mL JC-1 染色工作液。取适量JC-1（200×），按照每50μL JC-1（200×） 加入8mL 超纯水的比例稀释JC-1。剧烈震荡充分溶解并混匀JC-1。然后再加入2mL JC-1 染色缓冲液（5×）， 混匀后即为JC-1 染色工作液。

二．阳性对照的设置

把试剂盒中提供的CCCP（10mM）推荐按照1∶1000 的比例加入到细胞培养液中，稀释至10μM，处 理细胞20 分钟。对于大多数细胞，通常10μM CCCP 处理 20 分钟后线粒体的膜电位会完全丧失，JC-1 染 色后观察应呈绿色荧光；而正常的细胞经JC-1 染色后应显示红色荧光。对于特定的细胞，CCCP 的作用浓 度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料决定。

三．对于悬浮细胞

1. 取10～60 万细胞，重悬于0.5mL 细胞培养液中，细胞培养液中可以含血清和酚红。

2. 加入0.5mL JC-1染色工作液，颠倒混匀数次。细胞培养箱中 37℃孵育 20 分钟。

3. 在孵育期间，按照每1mL JC-1 染色缓冲液（5×）加入 4mL 蒸馏水的比例，配制适量的JC-1 染色 缓冲液(1×)，并放置于冰浴。

4. 37℃孵育结束后，600g 4℃离心 3～4 分钟，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸出细胞。

5. 用JC-1 染色缓冲液（1×）洗涤 2 次：加入1mL JC-1 染色缓冲液（1×）重悬细胞，600g 4℃离心 3～ 4 分钟，沉淀细胞，弃上清。再加入1mL JC-1 染色缓冲液（1×）重悬细胞，600g 4℃离心 3～4 分钟，沉 淀细胞，弃上清。

6. 再用适量 JC-1 染色缓冲液（1×）重悬后，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光 分光光度计检测或流式细胞仪分析，参考步骤 6

四．对于贴壁细胞

1．对于 6 孔板的一个孔，吸除培养液，根据具体实验如有必要可以用 PBS 或其它适当溶液洗涤细胞 一次，加入1mL 细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。

2．加入1mL JC-1 染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中 37℃孵育 20 分钟。

3．在孵育期间，按照每1mL JC-1 染色缓冲液（5×）加入4mL蒸馏水的比例，配制适量的JC-1 染色 缓冲液（1×），并放置于冰浴。

4．37℃孵育结束后， 吸除上清，用JC-1 染色缓冲液（1×）洗涤 2 次：加入1mL JC-1 染色缓冲液（1×） 重悬细胞，600g 4℃离心 3～4 分钟，沉淀细胞，弃上清。再加入1mL JC-1 染色缓冲液（1×）重悬细胞， 600g 4℃离心 3～4 分钟，沉淀细胞，弃上清。

5．加入2mL 细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红。

6．荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。注意：对于贴壁细胞，如果用荧光分光光度计或流式细胞 仪检测，先收集细胞，重悬后参考步骤 6

五．对于纯化的线粒体

1．把配制好的JC-1 染色工作液再用JC-1 染色缓冲液（1×）稀释 5 倍。

2．0.9mL 5 倍稀释的JC-1 染色工作液中加入 0.1mL 总蛋白量为 10～100μg 纯化的线粒体。

3．用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测：混匀后直接用荧光分光光度计进行时间扫描（time scan）， 激发波长为485nm，发射波长为590nm。如果使用荧光酶标仪，激发波长不能设置为485nm 时，可以在 475～520nm 范围内设置激发波长。另外，也可以参考步骤 6。

六．荧光观测和结果分析

检测 JC-1 单体时可以把激发光设置为490nm，发射光设置为530nm；

检测 JC-1 聚合物时，可以把激 发光设置为525nm，发射光设置为590nm。

注意：此处测定荧光时不必把激发光和发射光设置在最大激发 波长和最大发射波长。如使用荧光显微镜观察，检测JC-1单体时可以参考观察其它绿色荧光时的设置，如 观察GFP或FITC时的设置；检测JC-1聚合物时可以参考观察其它红色荧光，如碘化丙啶或Cy3时的设 置。出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降，并且该细胞很可能处于细胞凋亡早期。出现红色荧光说明线粒 体膜电位比较正常，细胞的状态也比较正常。

保存条件

-20℃避光保存，尽量避免反复冻融，有效期一年。

注意事项

1、 JC-1（200×）在 4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以在 20～ 25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。

2、 必须先把JC-1（200×）用试剂盒提供的超纯水充分溶解混匀后，才可以加入JC-1 染色缓冲液（5×）。 不可先配制JC-1 染色缓冲液（1×）再加入JC-1（200×），这样JC-1 会很难充分溶解，会严重影响后 续的检测。

3、 加入JC-1 染色工作液后用JC-1染色缓冲液（1×）洗涤时，使JC-1染色缓冲液（1×）保持 4℃左右， 此时的洗涤效果较好。

4、 JC-1 染色工作液加入并洗涤后尽量在 30 分钟内完成后续检测；在检测前需冰浴保存。

5、 请勿把JC-1染色缓冲液（5×）全部配制成JC-1染色缓冲液（1×），在配置JC-1染色工作液需使用JC-1染色缓冲液（5×）。

6、 如果发现JC-1染色缓冲液（5×）中有沉淀，必须全部溶解后才能使用，为促进溶解可以在 37℃加 热。

7、 CCCP为线粒体电子传递链抑制剂，有毒，请小心防护。

8、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。