基本介绍

胶原蛋白是结缔组织和内脏器官细胞外基质的主要构造成分，但在皮肤、肌腱、骨骼中分布最为广泛。从遗传和结构上胶原蛋白分为许多类型。胶原蛋白I（Collagen, Type I）是由2个α1链和1个α2链组成的异源多聚体，在37℃，中性pH下自发形成三螺旋骨架，是一种优秀的细胞培养用基质，广泛用于肝细胞、成纤维细胞、脊神经节、肌肉细胞、施万细胞、胚肺细胞、上皮细胞和其他大量细胞系。还能用于研究细胞生长、分化、迁移以及发育过程中的组织形态发生。

懋康生物提供的鼠尾胶原蛋白I是根据Birkedal-Hansen方法，通过促酸抽提、氯化钠沉淀、磷酸氢二钠沉淀等步骤制备。可用于包被细胞培养器皿，培养细胞表面粘附性，特别适合那些在普通培养器皿表面不易贴壁的细胞，比如成纤维细胞、肝细胞等原代细胞。还可用于三维胶的制备，模拟真实的生长环境，使得细胞在三维环境中生长。

本品为溶于6mM HAc的无菌溶液，浓度5mg/ml，每个批次产品皆通过细胞培养测试（包括三维空间培养）以保证质量的可靠性。

使用方法

1. 细胞培养器皿的表面包被

组织培养器皿的表面包被推荐浓度为1-5µg/cm2，起始浓度可选5µg/cm2。建议根据具体细胞类型来优化。

1.1 6mM HAc稀释液的制备

本品以溶于6mM HAc（=0.36g/L HAc）的无菌溶液形式提供，本身不溶于中性pH，建议用6mM HAc溶液做进一步稀释。

配制方法：取34.5µl冰促酸（17.4 M）加入100ml双蒸水，充分混匀后即得到6mM HAc溶液，0.22µm滤膜过滤除菌后待用。

1.2 包被步骤

a，根据自身实验体系以及优化后的包被浓度来计算所需的胶原蛋白量，并加入相应孔内，确保胶原蛋白溶液完全覆盖表面。

1）以包被浓度为5µg/cm2，先用6mM HAc稀释液将胶原蛋白（5mg/ml）稀释到合适的中间浓度，如50µg/ml，然后参考表1不同培养皿内胶原蛋白加量表来加量到各孔内；

2）以包被浓度为2µg/cm2，先用6mM HAc稀释液将胶原蛋白（5mg/ml）稀释到合适的中间浓度，如12µg/ml，然后参考表1不同培养皿内胶原蛋白加量表来加量到各孔内；

表1 不同培养皿内胶原蛋白加量表

b，室温孵育1h，小心吸掉多余液体，用无菌PBS清洗3~4次后直接使用。或者加完胶原蛋白溶液后，在超净台内开盖过夜晾干。无菌条件下，包被好的器皿在4-25℃至少可保存3个月。

2. 三维胶原的制备

当鼠尾胶原蛋白I使用浓度>1mg/ml，pH 7.0左右皆可形成具有一定强度的三维胶，建议成胶浓度为1-2 mg/ml。

由于本品是以溶于6mM HAc的无菌溶液形式提供，在成胶过程需先加入0.06倍体积的0.1M NaOH中和。

2.1 需要溶液准备（无菌、预冷）

10×PBS（可含酚红）或10×细胞培养液

0.1M NaOH

双蒸水

2.2 三维胶原制备（不含细胞）（以配制1ml，1mg/ml三维胶为例）：

a，取200µl胶原蛋白（5mg/ml）加到置于冰浴的离心管内，加入690µl无菌水。之后加到12µl 0.1M NaOH【注意：该步骤不能反，如果反过来把12µl 0.1M NaOH加到胶原溶液中，会由于NaOH不能迅速混匀而产生局部的胶原凝结】，立即混匀。再加入100µl 10×PBS或10×细胞培养液，混匀后立即加到培养器皿中【注意：混匀后pH为7.0左右，如果PBS或培养液中没有加酚红，初次使用时需要用pH试纸测试】。

b，将培养器皿在室温（25℃左右）放置20min待胶凝固后，转移到培养箱内。【注意】：如果配制中使用的是10×PBS，需要在做细胞培养前，先加入适当体积的细胞培养液预平衡。

2.3 三维胶原制备（含细胞）（以配制1ml，1mg/ml三维胶为例）：

a，准备好细胞悬液，并放置于冰浴中。

b，将200µl胶原蛋白（5mg/ml）加到12µl 0.1M NaOH【注意：该步骤不能反，如果反过来把12µl 0.1M NaOH加到胶原溶液中，会由于NaOH不能迅速混匀而产生局部的胶原凝结】，立即混匀。再加入23µl 10×PBS或者10×细胞培养液，立即混匀【注意：混匀后pH为7.0左右，如果PBS或培养液中没有加酚红，初次使用时需要用pH试纸测试】。再加入760µl的细胞悬浮液，混匀后立即加到培养器皿中。

c，将培养器皿在室温（25℃左右）放置20min待胶凝固后，加入适当体积细胞培养液，转移到培养箱中培养。

保存与运输方法

保存：2-8℃保存，不可冻存，一年有效。

运输：冰袋运输。

注意事项

1）整个操作请于冰上进行，因室温鼠尾胶原I可迅速成胶，操作过程尽量保持低温。

2）整个操作请在无菌环境下无菌操作，避免污染以影响细胞生长。 

3）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。